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1.1慢病毒:
1.1.1原理
慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种(单链RNA病毒)。构建的siRNA?/miRNA慢病毒载体,与化学合成的siRNA?和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA?载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,Lentivirus-siRNA?克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行 长时间的稳定表达 。
1.1.2特点
1)直接包装成为 假病毒颗粒 ,对分裂和非分裂细胞均有感染作用,适合RNAi?研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2)可以通过简单方式,在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3)可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂 ,操作简便。
5)可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程:
1)含有目的基因的慢病毒RNAi?干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2)慢病毒载体,包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3)培养48hrs?-?72hrs?左右,收集含有病毒的上清培养液。
4)病毒的纯化和浓缩。
5)分装、-?80?℃保存。
6)滴度测定目的基因检定,并出具检测报告。
1.2、腺病毒
1.2.1原理
腺病毒(Adenovirus,Ad)是一种无包膜的线状 双链DNA病毒 ,其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型,大多数Ad载体都是基于血清型2和5,通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达 E1和E3基因的细胞 中复制,因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
1.2.2特点
1)几乎可以感染所有类型的细胞
2)可以获得复制缺陷型(E1?和E3?缺失)?的腺病毒
3) 病毒滴度 高,产生病毒经过浓缩后可以达到1012?PFU/mL,能有效的进行增殖。
4)腺病毒载体感染宿主的范围比较广,制备容易,操作简单.
5)感染细胞时,不整合到染色体中,不存在激活致癌基因或插入突变等危险,生物安全性
高。
1.2.3腺病毒包装简要流程
1)构建表达siRNA/miRNA?的腺病毒载体
2)采用PacI?消化纯化的质粒。
3)消化好的腺病毒表达载体转染293A?细胞,收获细胞以制备病毒粗提液。
4)将病毒粗提液感染293A?细胞以扩增病毒。
5)分装,-80℃保存。
常染色体显性(autosomal dominant,AD)遗传病:
如果一种遗传病的致病基因位于1-22号染色体上,在与正常基因组成杂合子时可导致个体发病,即致病基因决定的是显性性状,这种遗传病成为常染色体显性遗传病。
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